대한민국약전 일부개정고시

1. 개정이유

「대한민국약전」의 기준·규격을 국제조화하고 의약품 제조‧품질관리 현장 의견을 반영하여 합리적으로 개선함으로써 의약품 수출을 지원하고, 우수한 품질의 의약품이 유통될 수 있도록 함

2. 주요내용

가. 「제미플록사신메실산염」의 기준·규격을 대한민국약전 및 미국약전에 공동 수재하여 국제조화 및 수출지원 강화(안 별표 3)

나.  「강활」 등 10개 품목의 규격 및 시험법 개선하여 한약재의 품질관리를 합리적으로 개선(안 별표 4)

다. 「당단백질의 당사슬분석법」등 2개의 시험법을 일반정보에 신설하여 당단백질의약품 및 재조합단클론항체의약품의 품질 평가에 유용한 정보를 제공(안 별표 6)

3. 기타 참고사항

가. 관계법령: 약사법

나. 예산조치: 별도조치 필요 없음

다. 합    의: 해당사항 없음

라. 기    타: (1) 행정예고(‘20.6.9 ∼ ‘20.8.7) 결과 특이사항 없음

(2) 규제심사: 신설․강화 규제 없음

식품의약품안전처 고시 제2020 - 88호

「약사법」 제51조제1항에 따른 「대한민국약전」(식품의약품안전처고시 제2019-102호, 2019. 11. 6.)을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2020년 9월 17일

식품의약품안전처장

대한민국약전 일부개정고시

대한민국약전 [별표 3] 의약품각조 제1부 일부를 다음과 같이 개정한다.

모메타손푸로에이트 중 비선광도를 다음과 같이 한다.

선 광 도	[eqn: rm [ alpha ] _{D}^{20}] : +50° ∼ +55° (건조한 다음 50 mg, 에탄올(95), 10 mL, 100 mm).

정제유로키나제 액 각조 다음에 제미플록사신메실산염을 별지 1과 같이 신설한다.

대한민국약전 [별표 4] 의약품각조 제2부 1) 생약 및 생약제제 중 일부를 다음과 같이 개정한다.

강활의 기원 중 “Boissier”를 “H. Boissieu”로 한다.

견우자의 확인시험 중 “카페인산표준품”을 “카페산표준품”으로 한다.

괄루근의 기원 중 “하눌타리”를 “하늘타리”로 한다.

괄루인의 기원 및 성상 중 “하눌타리”를 각각 “하늘타리”로 한다.

마황의 확인시험 중 “가루”를 “가루 및 마황표준생약”으로, “검액”을 “검액 및 마황표준생약표준액”으로, “검액 10 μL를”을 “검액 및 마황표준생약표준액 10 μL씩을”으로, “n-부탄올”을 “1-부탄올”로, “Rf 값 0.35 부근에 적자색의 반점을 나타낸다.”를 “검액에서 얻은 여러 개의 반점은 마황표준생약표준액에서 얻은 색상 및 Rf 값이 같다.”로 한다.

사프란의 순도시험 1) 이물 본문 중 가) 를 삭제하고, “나)”를 “가)”로, “다)”를 “나)”로 하며, 순도시험 중 “2)”를 “3)”으로, “3)”을 “4)”로 하고, 2) 를 다음과 같이 신설한다.

2) 아닐린색소  이 약 50 mg에  클로로포름 10mL를 넣고 흔들어 섞을 때 액은 무색이거나 노란색을 띠더라도 매우 연하다.

연교의 함량규정 중 “포르시티아시드 A”를 각각 “포르시티아시드”로 하고, 정량법 1)과 2) 중 “포르시티아시드 A표준품”을 각각 “포르시티아시드표준품”으로 하고, “(55 : 45)”를 “(11 : 9)”로 한다.

오배자의 확인시험 중 “갈릭산표준품”을 “갈르산표준품”으로 한다.

오수유의 함량규정과 정량법 중 “루테카르핀”을 각각 “루태카르핀”으로 하고, 확인시험 1)의 본문 중 “검액으로 하여 다음 시험을 한다. 가) 검액 1 방울을 여과지 위에 떨어뜨리고 바람에 말린 다음 드라겐도르프시액을 뿌려 방치할 때 황적색을 띤다. 나)”를 “검액으로 한다.”로 하고, 확인시험 2)의 본문 중 “20 μL”을 “2 μL”로 하고, “묽은황산시액을 고르게 뿌린 다음”을 “분무용황산시액을 고르게 뿌린 다음 105 ℃에서 10 분간 가열 후”로 하며, 정량법 중 “(50 : 50)”을 “(1 : 1)”로 한다.

조각자 기원 중 “Gleditsia japonica Miquel var. koraiensis Nakai”를 “Gleditsia japonica Miquel”로 한다.

대한민국약전 [별표 5] 일반시험법 일부를 다음과 같이 개정한다.

83. 표준품, 시약·시액, 용량분석용표준액, 표준액, 색의 비교액, 파장 및 투과율 보정용 광학필터, 계량기·용기, 멸균법 및 무균조작법 중 6) 파장 및 투과율 보정용 광학필터를 별지 2와 같이 한다.

대한민국약전 [별표 6] 일반정보 일부를 다음과 같이 개정한다.

완제의약품 중 금속(원소)불순물 평가 및 관리 중 표 1. 금속불순물의 PDE값의 Pt 경구 PDE “1000”을 “100”으로, 표 3. 방법 1에 따른 금속불순물 허용 농도의 Pt 경구제 농도 “100”을 “10”으로 한다.

당단백질의 당사슬분석법 및 재조합 단클론항체의약품 품질분석 시험법을 별지 3과 같이 신설한다.

부      칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시 후 3개월이 경과한 날부터 시행한다.

제2조(적용례) 이 고시는 이 고시 시행 후 최초로 의약품 제조업자가 제조하거나 수입자가 수입한 의약품부터 적용한다.

[별지 1]

제미플록사신메실산염

Gemifloxacin Mesilate

C18H20FN5O4·CH4O3S : 485.49

(Z)-7-[3-(Aminomethyl)-4-(methoxyimino)-1-pyrrolidinyl]-1-cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid monomethanesulfonate;

(±)-7-[3-(Aminomethyl)-4-oxo-1-pyrrolidinyl]-1-cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid, 74-(Z)-(O-methyloxime),monomethanesulfonate;

(Z)-7-[3-(Aminomethyl)-4-(methoxyimino)pyrrolidin-1-yl]-1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihydro-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid methanesulfonate [210353-53-0]

이 약은 정량할 때 환산한 무수물 및 무용매물에 대하여 제미플록사신메실산염 (C18H20FN5O4·CH4O3S) 98.0 ∼ 102.0 %를 함유한다.

제    법  이 약의 제조공정에 따라 메탄술폰산의 알킬(메틸, 에틸, 이소프로필 등) 에스테르류(alkyl methanesulfonate esters)가 잠재적 불순물로 혼입될 가능성이 있는 경우, 위해평가 결과를 고려하여 불순물의 잔류량을 최소화할 수 있도록 출발물질, 제조공정 및 중간체 관리에 유의한다. 필요한 경우, 최종 원료의약품 중 품질 위해성이 없음을 입증한 시험자료로 제조공정의 타당성을 입증할 수 있다.

성    상	이 약은 흰색 또는 밝은 갈색의 가루이다.

이 약은 물에 잘 녹고 메탄올 또는 에탄올(99.5)에 매우 녹기 어려우며, 아세톤 및 클로로포름에는 거의 녹지 않는다. 이 약은 흡습성이 있다

융점 : 200 ∼ 205 ℃ (분해)

확인시험	1) 이 약 및 제미플록사신메실산염표준품을 적외부스펙트럼측정법의 페이스트법에 따라 측정할 때 같은 파수에서 같은 강도의 흡수를 나타낸다.

2) 정량법의 검액에서 얻은 주피크의 유지시간은 표준액에서 얻은 주피크의 유지시간과 같다.

3) 이 약은 메실산염의 정성반응 1)을 나타낸다.

순도시험  유연물질  이 조작은 빛을 피하여 차광한 용기를 써서 한다. 이 약에 희석액을 넣어 0.5 mg/mL로 하여 검액으로 한다. 따로 제미플록사신메실산염표준품에 희석액을 넣어 0.0005 mg/mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 5 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험한다. 각 액의 피크면적을 자동적분법에 따라 측정하여 유연물질의 양을 구할 때 각 유연물질의 양은 허용기준 (%) 이하이다.

유연물질의 양 (%) = [eqn: {C _{rm `S it}} over {C _{rm T}} TIMES {A _{rm I}} over {A _{rm S}} TIMES {1} over {F} TIMES 100]

CS : 표준액 중 제미플록사신메실산염의 농도 (mg/mL)

CT : 검액 중 이 약의 농도 (mg/mL)

Ai : 검액에서 얻은 각 유연물질의 피크면적

AS : 표준액에서 얻은 제미플록사신의 피크면적

F : 상대반응계수

화합물	상대유지 시간	측정파장 (nm)	상대보정 인자	허용기준 (%)
제미플록사신 유연물질 A*	0.16	207	0.43	0.15
제미플록사신 유연물질 B	0.33	272	1.0	0.2
제미플록사신 유연물질 C	0.37	272	1.0	0.1
제미플록사신 E-이성질체	0.77	272	1.0	0.7
제미플록사신	1.0	272	-	-
나프티리딘 카르복실산유사체*	1.79	272	0.45	0.15
제미플록사신 이량체	1.97	272	0.90	0.15
개개 유연물질	-	272	1.0	0.1
총 유연물질	-	-	-	1.5

* 제조공정에 따라 생성될 가능성이 있는 경우 적용한다.

◦ 희석액 : 물·아세토니트릴혼합액(80 : 20)

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 : 0 ∼ 5 분 207 nm, 5.1 ∼ 37 분 272 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 25 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : 이동상 A 및 이동상 B를 가지고 다음과 같이 단계적 또는 농도기울기적으로 제어한다.

이동상 A - 물·아세토니트릴·트리플루오로아세트산혼합액(80 : 20 : 0.1)

이동상 B - 아세토니트릴·물·트리플루오로아세트산혼합액(80 : 20 : 0.1)

시간(분)	이동상 A (vol %)	이동상 B (vol %)
0 ∼ 15	100	0
15 ∼ 35	100 → 0	0 → 100
35 ∼ 37	0 → 100	100 → 0

유  량 : 1.0 mL/min

시스템적합성

시스템의 성능 : 제미플록사신메실산염표준품에 희석액을 넣어 0.5 mg/mL로 하여 시스템적합성용액으로 한다. 이 액 5 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 제미플록사신 E-이성질체와 제미플록사신 분리도는 5.0 이상이다. 제미플록사신메실산염표준품에 희석액을 넣어 0.25 μg/mL로 하여 민감도확인용액으로 한다. 이 액 5 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 신호대 잡음비는 10 이상이다.

시스템의 재현성 : 표준액 5 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 제미플록사신 피크면적의 상대표준편차는 10 % 이하이다.

수    분  4.0 ∼ 7.0 % (0.1 g, 용량적정법, 직접적정)

강열잔분  0.1 % 이하 (1 g)

정 량 법  이 조작은 빛을 피하여 차광한 용기를 써서 한다. 이 약을 물에 녹여 0.5 mg/mL로 하여 검액으로 한다. 따로 제미플록사신메실산염표준품을 물에 녹여 0.5 mg/mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 5 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 제미플록사신 피크면적 [eqn: r_{ rmU}] 및 [eqn: r _{rm S it}]를 측정한다.

제미플록사신메실산염 (C18H20FN5O4·CH4O3S)의 함량 (%) = [eqn: LEFT ( {r _{rmU}} over {r _{rmS}} RIGHT ) TIMES LEFT ( {C _{rmS}} over {C _{rmU}} RIGHT )]×100 (%)

[eqn: r_{ rmU}] : 검액에서 제미플록사신의 피크면적

[eqn: r _{rm S it}] : 표준액에서 제미플록사신의 피크면적

[eqn: C _{rm S it}] : 표준액에서의 제미플록사신메실산염표준품의 농도 (mg/mL)

[eqn: C _{rm U it}] : 검액에서의 제미플록사신메실산염의 농도 (mg/mL)

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 : 272 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 25 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : 물·아세토니트릴·트리플루오로아세트산혼합액(80 : 20 : 0.1)

유  량 : 1 mL/min

측정범위 : 제미플록사신 유지시간의 1.2 배 이상

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 5 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 제미플록사신 E-이성질체와 제미플록사신 분리도는 5.0 이상이고, 제미플록사신 피크의 대칭계수는 1.5 이하이다.

시스템의 재현성 : 표준액 5 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 제미플록사신 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

저 장 법 차광한 밀폐용기.

참    고

제미플록사신유연물질 A : (Z)-4-(아미노메틸)피롤리딘-3-온 O-메틸 옥심 디메탄설포네이트

제미플록사신유연물질 B : (R,S)-7-(3-아미노메틸-4-히드록시-1-피롤리디닐)-1-시클로프로필-6-플루오로-1,4-디히드로-4-옥소-1,8-나프티리딘-3-카르복실산

제미플록사신유연물질 C : 7-[3-(아미노메틸)-4-옥소-1-피롤리딘-1-일]-1-시클로프로필-6-플루오로-4-옥소-1,4-디히드로-1,8-나프티리딘-3-카르복실산 모노메탄설포네이트

제미플록사신 E-이성질체 : (E)-7-[3-(아미노메틸l)-4-(메톡시이미노)피롤리딘-1-일]-1-시클로프로필-6-플루오로-4-옥소-1,4-디히드로-1,8-나프티리딘-3-카르복실산 모노메탄설포네이트

나프티리딘카르복실산유사체 : 7-클로로-1-시클로프로필-6-플루오로-1,4-디히드로-4-옥소-1,8-나프티리딘-3-카르복실산

제미플록사신이량체 : (Z)-7-({[1-(6-카르복시-8-시클로프로필-3-플루오로-5-옥소-5,8-디히드로-1,8-나프티리딘-2-일)-4-(메톡시이미노)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-1-시클로프로필-6-플루오로-1,4-디히드로-4-옥소-1,8-나프티리딘-3-카르복실산

[별지 2]

6) 파장 및 투과율 보정용 광학필터

파장 및 투과율 교정용 광학필터는 교정 대상 장비의 파장을 고려하여 다음 중 적합한 것을 쓴다. 투과율 교정용 광학필터는 흡광도의 교정에도 쓴다.

투과율 교정용 광학필터

한국표준과학연구원에서 제공하는 교정용 광학필터 C70329-00 분광투과율(Spectral Transmittance) 표준물질

교정방법 : 기준분광광도계를 사용하여 기록된 파장에서의 분광투과율을 측정한다.

구분 : 저투과율 10 %, 중투과율 30 % ∼ 50 %, 고투과율 90 %

측정범위 : 250 nm ∼ 750 nm 중 10개 이상의 지점 측정, 간격 50 nm

파장 교정용 광학필터

1) 한국표준과학연구원에서 제공하는 교정용 광학필터 C70326-01 파장 교정필터 (Wavelength Calibration Filter)

교정방법 : 기준분광광도계를 사용하여 기록된 파장 범위 내에서 분광흡광 피크들을 여러 파장폭으로 측정한다.

측정범위 : 380 nm ∼ 780 nm 중 10 개 이상의 지점 측정

2) 한국표준과학연구원에서 제공하는 교정용 광학필터 C70326-02 파장 교정필터 (Wavelength Calibration Filter)

교정방법 : 기준분광광도계를 사용하여 기록된 파장 범위 내에서 분광흡광 피크들을 여러 파장폭으로 측정한다.

측정범위 : 240 nm ∼ 640 nm 중 9 개 이상의 지점 측정

[별지3]

당단백질의 당사슬분석법

서론

당사슬분석법은 당단백질의 당사슬(glycan) 부위를 분석하는 시험법으로 원 당단백질(intact glycoprotein) 분석, 단백질의 당사슬변이형(glycoform) 분리 및 검출, 당단백질을 효소로 처리하여 얻어진 당펩타이드 분석, 그리고 당단백질을 화학물질 또는 효소로 처리하여 얻어진 유리 당사슬 분석 등이 포함된다. 한편 단당류 분석은 당사슬분석에 의해 얻어지는 정보를 보완할 수 있다.

당사슬 결합(glycosylation)은 단백질을 주성분으로 하는 생물의약품의 기능, 약동학, 약력학, 안정성 및 면역원성을 결정하는 데 매우 중요한 역할을 한다. 당사슬 결합은 전사와 달리 주형을 바탕으로 작동하는 효소 반응이 아니기 때문에 당사슬의 불균질성(heterogeneity)을 가져온다. 제조공정도 당사슬의 불균질성에 영향을 준다. 따라서 당단백질의 당사슬분석은 당사슬 형태의 가변성을 확인하고 생산 공정의 일관성을 모니터링하기 위한 중요한 시험이다. 또한 당사슬분석은 유사하게 처리된 표준물질과 비교하여 정보를 얻기 때문에 제품의 일관성을 입증하는 비교 절차이기도 하다.

여기에서는 당단백질의 당사슬분석에 사용되는 분석 방법과 이의 적용 및 검증에 요구되는 조건들에 대한 정보를 제시한다. 다른 한편 당사슬분석은 단일한 일반시험법이 아니며 개별 당단백질마다 특정한 절차 적용과 분석법 개발이 필요함을 밝혀둔다.

단백질의 당사슬 결합

단백질에 당사슬이 결합되는 과정은 여러 단계를 거치는 매우 복잡한 생합성 과정이다. 단백질에는 아스파라긴 말단 아미드기의 질소에 올리고당이 결합된 N-당사슬, 세린, 트레오닌 및 히드록시 프롤린의 수산화기에 올리고당이 결합된 O-당사슬 그리고 트립토판 인돌 고리의 C2 탄소에 α-만노피라노오스가 결합된 C-당사슬 등 세 가지 주요한 당사슬 결합 형태가 존재한다. 그리고 당화반응(glycation)이라고 하는 비효소적 당 결합 반응은 단백질이 환원당과 함께 존재할 때 일어날 수 있다.

여기에서는 당단백질 의약품에서 가장 흔히 발견되는 N-당사슬과 O-당사슬에 대한 분석 방법들을 설명한다.

N-당사슬 결합

당단백질에서 N-당사슬의 생합성은 네 단계 과정으로 기술될 수 있다.

1) 지질에 결합된 당사슬의 생합성 개시 및 신장

2) 단백질 또는 폴리펩타이드로 당사슬의 전달

3) N-당사슬로부터 특정 글루코스와 만노스 잔기의 제거

4) 당사슬의 비환원 말단에 잔기 첨가로 인한 N-당사슬의 변형

N-당사슬은 만노스형, 조합형 및 복합형으로 구분된다(그림 1). 만노스형에는 핵심 당사슬 말단에 갈락토오스 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기가 없고 만노스가 결합되어 있다. 조합형 구조에는 핵심 당사슬 말단에 GlcNAc과 만노스가 모두 결합되어 있으며 복합형 구조에서는 핵심 당사슬 말단의 만노스에 GlcNAc가 결합된다. 조합형과 복합형에서는 핵심 당사슬에 안테나라고 부르는 두 개 이상의 가지가 존재하며 이러한 당사슬은 다시 2가지-안테나형(biantennary), 3가지-안테나형(triantennary) 및 4가지-안테나형(tetraantennary)로 구분된다. 한편 단가지-안테나형(monoantennary)과 5가지-안테나형(pentaantennary) N-당사슬도 존재하는 것으로 알려져 있다. 복합형 당사슬의 안테나 말단에는 흔히 시알산(N-아세틸뉴라민산, Neu5Ac) 잔기가 결합되는데 이와 같은 시알산화는 많은 당단백질 치료제의 약동학 및 약력학 모두에 큰 영향을 준다.

그림 1. N-당사슬의 일반적인 유형

O-당사슬 결합

O-당사슬은 세린, 트레오닌 및 티로신뿐만 아니라 덜 일반적인 아미노산인 하이드록시 프롤린 및 하이드록시 리신에 연결된 N-아세틸-D-갈락토사민(N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc) 잔기로부터 순차적으로 결합되어 만들어지는데 여러 가지 핵심 당사슬 구조가 알려져 있다. 단당류의 결합 순서와 이성체 결합은 N-당사슬 보다 더 다양하며 적어도 여덟 가지 유형이 확인되었다(그림 2). O-당사슬이 결합된 부위의 아미노산 서열에 공통점이 발견되지는 않지만, 일반적으로 당사슬이 결합되는 아미노산 보다 아미노산 하나 앞 또는 아미노산 세 개 뒤에 프롤린이 존재하고 결합 부위에 있는 세린 또는 트레오닌과 인접한 곳에 전하를 띤 아미노산 잔기가 없는 경우가 보통이다. O-당사슬에서는 이당류인 N-아세틸락토사민(N-acetyllactosamine, Galβ1, 4GlcNAc)이 가장 일반적인 연결 단위이다. 그 외에는 갈락토오스에 시알산이 결합되거나 당사슬에 푸코오스(fucose)가 흔히 결합된다.

O-당사슬 결합은 뮤신(mucin)과 같은 세포 표면 단백질이나 분비 당단백질에 존재하며, O-GlcNAc과 같은 다른 O-당사슬 결합은 많은 핵/세포질 단백질에서 발견된다. 또한 O-만노스가 연결된 당사슬 결합은 일부 근육과 신경의 당단백질 그리고 효모에서 발견된다. O-푸코오스 및 O-글루코사민 연결 당사슬 결합은 노치(Notch) 신호 전달 경로와 관련된 많은 EGF(epidermal growth factor, 표피 성장 인자)-유사 단백질에서 발견된다.

그림 2. O-당사슬의 핵심 공통 구조

당단백질의 불균질성

당사슬의 형태(N- 또는 O-), 결합 자리수, 당사슬 결합 위치 등 물론 당사슬의 실제 올리고당 구조(가지 및 연결 구조)도 당단백질마다 다르다. 이러한 구조적 변이는 당사슬 결합이 주형에 의존하지 않는 과정이기 때문에 발생한다. 어떤 부위에서 당사슬 결합 양상은 다양한 요인에 의존하는데 여기에는 골지체와 당사슬의 불균질성은 당단백질 생합성 과정에서 나타난다. 이러한 불균질성은 당사슬의 점유(완전, 부분 또는 비점유), 당사슬 결합(N-결합 또는 O-결합), 올리고당의 구조(연장, 가지, 연결) 등의 가변성으로부터 발생한다. 이러한 당사슬 결합에서 불균질성은 한 특정 당단백질에서도 다양한 당사슬 형태들을 초래한다. 전사나 번역과 달리 당사슬 결합은 주형에 의존하지 않는 번역 후 수식과정이기 때문에 이러한 가변성이 발생한다. 주어진 위치에서의 당사슬 결합은 세포 특이적, 그리고/또는 성장 의존적인 골지체 및 소포체 내 당전위효소나 당외분해효소의 유효성 등을 포함한 많은 요소들에 의해 영향을 받는다. 따라서 단백질 당사슬 결합은 단백질 구조, 생산 공정, 숙주-벡터 발현계 및 세포배양조건들에 의해서도 영향을 받는다.

당단백질 생물의약품에서 당사슬분석과 분석법 선택

단백질의 당사슬 결합은 직간접적으로 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있으며, 당사슬 결합의 가변성은 세포 다양성과 더불어 제조 공정으로 인해 나타난다. 따라서 당사슬 결합 양상을 확인하는 것은 공정의 일관성을 보증하는 중요한 요소이며 시장 진입 후 생물학적 제제의 일정한 품질을 보장하는 데도 중요하다. 배치 간 일관성을 보장하기 위한 생물학 및 물리 화학적 시험을 수행하기 위해 적절히 특성분석된 표준품이 필요하다. 당사슬 분석은 다음 분야에 적용하는데 적합하다.

1) 신규 제품의 구조 및 안정성, 생산 공정 및 저장 과정에서의 안정성 확인

2) 배치 출하 시험 및 공정 제어 시험

3) 제품 간 동등성 평가(예, 하나 이상의 과정이 변경되었을 경우)

당사슬 구조와 생물학적 기능 간 관계에 대한 이해는 각 개발 단계에서 필요한 정보를 결정하는데 중요하다. 생물의약품의 원료에 대한 특성 기준 및 규격은 일반적으로 ICH 가이드라인 Q6B(생물의약품에 대한 시험절차 및 허용기준)와 ICH 가이드라인 Q5E(제조공정 변경에 따른 생물의약품의 동등성 비교)에 명시되어 있다. 매우 다양한 접근법과 방법론이 당사슬 프로파일링(profiling) 또는 맵핑(mapping)에 적용되는데 이는 당사슬 구조 및 분석 기술의 다양성 및 복잡성에 기인한다. 한편 생물학적 활성에 영향을 미치는 단백질의 당사슬 결합 유형 중 가장 연구가 많이 된 것은 N- 및 O-당사슬 결합이다.

당사슬분석은 여러 분야에 응용할 수 있는데 가장 중요한 것은 제품 특성분석, 공정 검증, 동등성 평가, 안정성 시험, 제조 공정의 일관성 모니터링 그리고 출하 시험 등이다. 제품 개발과 생산에서 분석 기술의 선택과 적용은 많은 요인들에 의존하는데 이 요인들에는 당단백질의 복잡성, 당사슬 결합과 안전성 및 유효성간 상관관계 이해 및 제조공정 제어의 설계 등이 포함된다. 심지어 당사슬 결합의 생물학적 역할이 확실하지 않을 때조차도, 당사슬 결합의 제어는 제조공정 일관성 척도로 고려될 수 있다.

그림 3A는 당사슬분석법 선택을 위해 유용한 가이드를 제공하며 그림 3B는 이용 가능한 분석 기술 및 장비에 대한 개요이다.

그림 3A. 당사슬분석법 선택을 위한 가이드

그림 3B. 당사슬분석법과 사용장비 개요

당사슬분석법

당사슬 결합의 불균질성은 원 당단백질의 분석, 당펩타이드(glycopeptide)의 분석, 유리된 당사슬 분석 및 단당류 분석 등 네 가지 별개의 보완적인 접근법에 의해 평가될 수 있다. 여기에서는 N- 및 O-당사슬을 가진 당단백질의 당사슬분석에 사용되는 방법들과 일반적인 요건들을 설명한다. 당사슬분석은 일반적으로 여러 단계의 과정을 거치며 수많은 방법들이 있다. 이런 방법의 다양성은 당사슬 구조의 다양성과 복잡성, 분석기술과 검출시스템의 접근성, 요구되는 정보 수준에 따른 접근방법의 광범위함 등에 기인한다.

그림 4는 일반적인 당사슬분석절차와 분석기술을 보여주고 있는데 당사슬의 구조와 기원에 따라 분석기술과 조건을 다양하게 변형할 수 있다.

대량의 원료나 간섭을 일으키는 부형제를 포함한 제형의 분석에서는 당단백질의 분리와 정제가 필요할 수 있다.

CE : 모세관전기영동법

HPAEC-PAD : 알칼리성 음이온교환크로마토그래피-펄스형 전류검출법

IEF : 등전점전기영동법

LC : 액체크로마토그래피법

MS : 질량분석법

PGC : 다공성 흑연크로마토그래피법

SDS-PAGE : 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔전기영동법

그림 4. 당사슬분석절차

원 당단백질 분석

당사슬을 가장 직접적으로 분석하는 방법은 원 분자(intact molecule)를 분석하는 것이다. 이 방법은 당단백질의 당사슬 결합 프로파일에 대한 정보를 제공한다. 그러나 이 방법은 분자가 크고 당사슬 결합 자리가 여러 개일 때는 제한된 정보만을 제공한다. 생물학적 활성과 관계되는 가장 중요한 당화 인자들 중 하나는 시알산 결합 정도인데 이것은 흔히 당단백질의 혈액내 반감기를 결정한다. 시알산 결합 정도 분석에는 전기영동법과 이온교환크로마토그래피법이 유용한다. 거의 모든 겔전기영동법이 단백질의 당사슬 결합 정도를 분석하는데 사용될 수 있으며 여기에는 폴리아크릴아마이드겔 전기영동법(PAGE), 등전점전기영동법(IEF) 등이 포함된다. 따라서 모세관 전기영동법(CE)도 이와 같은 분석에 적용가능하다. 다른 한편 음이온 교환 크로마토그래피법이 같은 목적에 활용할 수 있는데 이 방법은 보통 분해능이 IEF나 CE에 비해 떨어진다. 직접 질량분석법 또한 단백질의 번역 후 변형(posttranslational modification)을 분석하기 위해 선택가능한 방법이며 질량분석법의 분해능이 개선됨에 따라 점점 더 복잡한 당단백질이 이 방법을 통해 특성 확인이 가능해지고 있다.

당펩타이드 분석

당펩타이드 분석은 위치 특이적인 당사슬 결합 특성, 당사슬 결합 정도 및 올리고당 구조에 대한 정보를 제공한다. 당펩타이드 분석은 당단백질의 효소 분해과정을 포함하며, 효소 절단 후 다음 방법들을 선택할 수 있다.

질량분석에 의한 직접 분석

당펩타이드 신호가 다른 펩타이드의 존재 때문에 억제되어서는 안 되기 때문에 당펩타이드가 전체 펩타이드 혼합물의 작은 부분일 경우나 당사슬가 결합되지 않은 펩타이드의 신호 보다 강도가 낮은 경우에는 주의를 요한다.

질량분석 전 당펩타이드의 분리

분리 단계를 추가함으로써 위에서 제기된 문제점을 해결할 수 있다. 농축 또는 분획화 기술이 직접 분석법과 병행 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 분리 기술로는 LC, CE 등이 적합하며 이를 질량분석기와 연결하여 분석에 활용할 수 있다.

당펩타이드의 당사슬 제거

당단백질의 당사슬 결합 위치는 원 당단백질과 당사슬을 제거한 단백질을 각각 단백질 분해하여 얻은 펩타이드 프로파일을 비교함으로써 확인할 수 있다.

원 당펩타이드와 당사슬이 제거된 펩타이드 사이의 질량 값 차이를 계산함으로써 당사슬 결합 위치에 대한 정보를 확보할 수 있으며 결합되어 있던 당사슬의 질량 값들은 당사슬 조성과 불균질성에 관한 정보를 제공할 수 있다. 앞서 언급한 것과 같은 분리 단계는 당사슬을 제거시키기 전이나 후에 실행될 수 있다.

유리된 당사슬분석

당사슬을 유리시켜서 분석하는 것은 단백질에 있는 다양한 당사슬 구조(2가지-안테나형, 3가지-안테나형 등)에 대한 정보를 얻는데 편리하다. 이러한 방법으로의 분석을 통해 시알산 결합 정도도 알 수 있다. 선택된 방법에 따라 당사슬 검출을 위해 사전 유도체화/표지 작업이 필요할 수도 있다. 유리 당사슬 분석의 일반적 과정은 반응 혼합액으로부터 당사슬의 정제 그리고 필요하다면 당사슬을 표지/유도체화 하는 단계를 포함한다. 그 후 당사슬의 프로파일링이 진행된다.

당사슬 유리

분석하고자 하는 당단백질에 따라 당사슬 유리에 사용되는 방법이 선택된다. 이때 사용되는 절단제는 필요한 절단 형태와 요구되는 정보의 정도에 의하여 결정된다. 당사슬 절단을 위해서는 효소적 또는 화학적 방법이 사용될 수 있으며, 표 1는 일반적으로 사용되는 효소 절단제에 대한 목록을 보여준다.

분해 효율성은 일반적으로 단백질 내 당사슬에 대한 절단제의 접근성에 의존하기 때문에 표면에 노출된 당사슬과 단백질 안쪽에 숨겨진 당사슬을 구별하는 것이 필요치 않다면, 당사슬 결합 부위 노출을 최대화하기 위해 단백질을 변성시킬 수 있다. 다른 한편 화학적 절단제로는 히드라진(hydrazine) 또는 알칼리성 수소화 붕소(alkaline borohydride)가 사용될 수 있다.

표 1. 당사슬 절단에 이용되는 효소 절단제

작용제	특이성
N-결합 당사슬 유리
펩타이드-N4-(N-아세틸-β-글루코사미닐)- 아스파라긴 아미다제	N4–(아세틸-β-D-글로코사미닐)아스파라긴 잔기의 가수분해 (이때 글루코사민 잔기에는 보통 추가적인 당사슬이 결합되어 있기 때문에 가수분해 되면 당화된 N-아세틸-β-D-글로코사미닐아민과 아스팔테이트를 함유하는 펩타이드를 생성함)
펩타이드 N-글리코시다제 F (PNGase F)	N-당사슬이 유리되지만 (α1-3)-결합된 푸코오스를 함유하는 N-당사슬은 유리되지 않음
펩타이드 N-글리코시다제 A (PNGase A)	(α1-3)-결합된 푸코오스를 함유하는 N-당사슬의 유리
만노실 당단백질 엔도-β-N-아세틸 글루코사이다제	[Man(GlcNAc)2 Asn 구조를 함유하는 만노스형 당펩타이드/당단백질에서 N, N4-디아세틸키토바이도실 단위의 가수분해
엔도-β-N-아세틸 글루코사이다제 F (endo F)	만노스형, 조합형, 복합형 올리고당의 유리
엔도-β-N-아세틸 글루코사이다제 H (endo H)	만노스형, 조합형 올리고당의 유리
O-결합 당사슬 유리
당 펩타이드 α-N-갈락토사미니다제*	말단 D-갈락토실-N-아세틸-α-D-갈락토사미니딕 잔기의 가수분해
* 이 효소는 높은 기질 특이성 때문에 사용에 제한이 있다.

N-당사슬의 화학적 또는 효소적 유리

PNGase F(Flavobacterium meningosepticum)는 대부분의 당단백질에서 N-당사슬을 유리할 경우 선택 가능한 효소이다. 그러나 일부 곤충 세포 및 식물의 당단백질에서 확인되는 Fucα1,3-결합 키토바이오실 핵심 구조(chitobiosyl core)를 가진 N-당사슬은 PNGase A에 의해서만 유리될 수 있다. 다른 한편 화학적 절단제인 히드라진은 매우 유해한 화학물질로 사용이 제한되어 있어 일반적으로 활용되지는 못한다.

O-당사슬의 화학적 또는 효소적 유리

현재 유일한  O-당사슬 분해효소로는 Diplococcus pneumoniae에서 유래된 효소가 있으나 기질 특이성이 너무 높아 사용이 제한적이다. 이 효소는 Galβ1,3GalNAcα1-세린/트레오닌만 절단한다. 더구나 O-당사슬을 유리시킬 수 있는 이상적인 화학적 방법도 현재는 없다. 그러나 보통 세린과 트레오닌에 결합된 O-당사슬은 환원성 알칼리 촉매반응인 β-제거 반응(알칼리 붕수소화 반응)에 의해 유리될 수 있다. 이때 유리된 당사슬은 분해를 막기 위해 유리 즉시 환원시켜야 한다. 그러나 이 반응은 특이적이지 않고 효율도 N-당사슬의 약 10 % ∼ 20 % 수준이다. 더구나 형광 표지를 위해 사용할 수 있는 환원기도 만들어지지 않는다. 그러나 다행히 질량분석기술의 발전으로 형광 표지 없이 직접 동정이 가능해졌다. 상대적으로 질 좋은 환원 O-당사슬은 에틸아민 및 히드라진과 같은 1차 아민을 사용한 알칼리 촉매반응인 β-제거에 의해 얻을 수 있으나 두 시약 모두 분해 산물을 생산할 가능성이 있다. 또한 에틸아민에 의한 O-당사슬 유리는 정량적이지 않다. 히드라진은 에틸아민보다 사용하기에 더 좋을 수도 있지만 반응 조건 및 취급에 엄격한 통제가 필요하다.

표지되지 않은 당사슬분석

형광표지되지 않은 당사슬 자체는 펄스형 전류검출기(pulsed amperometric detection, PAD)를 가진 알칼리성 음이온교환크로마토그래피법(HPAEC-PAD), 다공성 흑연 크로마토그래피법(PGC) 그리고 질량분석법(MS) 등으로 분석할 수 있다. HPAEC-PAD는 감도가 높으며 일부 이성질체도 분리할 수 있다. 그러나 올리고당 구조가 다르면 신호 대 반응 정도도 달라 올리고당 표준물질 라이브러리가 없으면 절대 정량이 불가능하다. 따라서 정량 분석은 특성이 잘 확인된 표준물질 라이브러리와의 비교를 통해 이루어지거나 총 피크면적에 대한 각 피크의 면적비를 통해 상대적으로 계산된다.

PGC는 전형적인 비극성 칼럼과 비교하여 더 큰 선택성을 가지기 때문에 당사슬 자체를 분리하는 데 사용될 수 있다. 또한 MS와 연계된 분석(PGC-MS)을 통해 당사슬 자체의 직접 동정분석도 수행할 수 있다.

표지된 당사슬분석

당사슬 표지

형광 표지물질을 사용한 유도체화는 당사슬 표지를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 단당과 올리고당 분자 마다 하나의 표지물질을 결합시켜 몰수를 결정할 수도 있다. 표 2는 가장 일반적으로 사용되는 형광 표지와 적절한 분석 기법을 보여주고 있다.

질량분석기만을 검출에 사용할 경우에는 당사슬의 메틸화가 표지 방법으로 활용될 수 있다.

표 2. 형광표지와 적합한 분석방법

이름	약어	구조	분석기술
2-아미노벤조산	2-AA		액체크로마토그래피법
2-아미노벤즈아미드	2-AB		액체크로마토그래피법, 질량분석법
2-아미노피리딘	2-AP		액체크로마토그래피법
8-아미노피렌-1,3,6-트리스설폰산삼나트륨	APTS		모세관전기영동법

당사슬분석

표지된 당사슬들은 LC, CE 및 MS와 같은 분석 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 당사슬의 분리와 정량은 당사슬의 분리특성에 따라 다양한 LC 시스템에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 소수성(hydrophobicity), 크기, 전하 등과 같은 당사슬의 특성은 각각 역상(reverse-phase), 정상(normal-phase), 그리고 음이온 교환 등과 같은 LC 시스템의 활용에 가능케 한다.

질량분석기(MS)의 병용

LC를 사용하여 형광 표지된 당사슬을 프로파일링하는 것은 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 당사슬 명명의 정확성은 당사슬 표준물질을 사용하거나 MS와의 연계를 통해 검증될 수 있다. 특히 LC와 MS의 연계(LC-MS)는 한번의 분석으로 상대 정량과 당사슬의 구조 분석을 가능케 한다. 이미 다른 방법을 통해 피크의 정체가 확인되었고 피크의 동질성이 보증되는 경우라면 LC 분석에서의 피크 유지시간(retention time)만으로도 피크 명명이 가능하다.

생체 분자의 반감기는 종종 시알산화에 의해 정해지기 때문에 당사슬의 시알산화 정도는 임상적 효능에 중요한 요소가 될 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피법은 시알산화 정도를 결정하기 위한 가장 간단한 방법이며, 당사슬 구조는 이것과 연계된 MS로 확인할 수 있다. 경우에 따라 MS 분석 전에 각 분획의 탈염 과정이 필요할 수도 있다.

CE와 같은 고해상도 분리 시스템은 특성이 잘 확인된 표준물질과의 비교를 통해 MS 없이 당사슬 구조를 식별하는 데 사용되어왔다. 그러나 CE-MS 시스템의 개발로 당사슬 구조분석력이 크게 향상되었다.

마이크로 효소 서열분석(Micro-Enzyme Sequencing) 활용

상세한 구조 정보가 필요한 경우 일반적으로 마이크로 효소 서열분석법을 이용하여 분석이 수행된다. 이러한 분석은 사용되는 효소의 특이성과 품질에 크게 의존한다. 최근에는 당사슬 구조를 확인하는데 병렬 MS가 일반적으로 사용되는데, 이 방법은 특히 잘 알려진 당단백질로부터 유리된 당사슬을 분석하는 경우 유용하다.

단당류 분석

다양한 단당류 정량분석법이 여러 가지 목적을 위해 수행된다. 단당류 분석은 당단백질에서 당의 상대적 양에 관한 정보와 특히 시일산 결합 정보를 제공한다. 이러한 단당류 조성 확인은 당사슬 구조 규명에도 일부 기여할 수 있다. 가장 간단한 단당류 분석법은 비색법으로 당사슬 유무와 당의 총량을 확인하는데 활용된다. 비색법은 당 종류에 대한 특이성이 매우 낮다.

일반적으로 단당류 조성 분석은 올리고당 프로파일링 보다 수행하기에 더 간단하며 얻을 수 있는 정보의 양도 적다. 가장 널리 사용되는 시험은 시알산의 정량으로 이 시험이 중요한 이유는 시알산이 소실되어 말단 갈락토오스 잔기가 노출되면 혈액 내에서 해당 당단백질이 빠르게 사라지기 때문이다.

단당류 분석은 두 가지 유형으로 나눌 수 있다.

1) 사전 분해 없이 원 시료에 대한 조성 정보를 제공하는 것(예, 비색법)

2) 분석 전에 당사슬의 가수분해가 필요하고 동시에 여러 단당류에 대한 정량적 정보를 제공하는 것(예, 크로마토그래피법). 가수분해 단계는 분석간 편차를 유발하는 중요한 과정으로 특정 시료에 대한 세밀한 최적화가 필요할 수도 있다.

특정 단당류의 존재는 특정 당사슬 구조임을 판단하는 근거가 될 수도 있다. 예를 들어, GalNAc이 관찰되면 대개 O-당사슬이 존재한다는 표시이고, 푸코오스는 특정 유형의 당사슬 존재를 시사한다. 당단백질의 당사슬에 존재하는 단당의 종류가 한정되어 있기 때문에 만노스, 갈락토오스 GlcNAc 등의 정확한 정량은 다양한 당사슬을 구별하는데 유용하다. 다른 한편 단당류인  Neu5Gc(N-glycolylneuraminic acid)는 사람에서는 발견되지 않기 때문에 당단백질 바이오의약품에 존재하는 Neu5Gc는 면역원성을 야기하는 성분으로 작용할 수 있다.

시료 준비

단당류 분석을 위해 당단백질 시료에는 염, 부형제 및 기타 제형 성분이 없어야 한다(저분자량의 당이 흔히 의약품 부형제로 사용됨). 이를 위해 다음과 같은 방법들이 사용될 수 있다.

1) 적절한 막을 사용하여 물 또는 휘발성 완충액을 투석 및 동결건조

2) 적절한 겔 투과 칼럼을 장착한 HPLC로 물 또는 휘발성 완충액을 용출시키고 이를 UV흡광도 또는 굴절계수로 모니터링한 후, 시료를 동결 건조

3) C18 또는 C8 SPE(Solid Phase Extraction)와 같은 역상 SPE 카트리지에 시료물질을 결합시킨 후, 염 및 부형제를 세척·제거하고 시료를 용출

정량

당단백질에 있는 중성당을 정량하는 일반적인 방법은 수용성 페놀과 진한 황산 존재 하에서 당사슬이나 당단백질을 가열할 때 나타나는 색을 측정하는 것이다. 많은 경우에, 이 반응에 필요한 열은 당단백질-페놀 혼합물에 진한 황산을 첨가함으로써 생성된다. 이 방법에서는 용액을 신속하고 효율적으로 혼합하는 것이 일관성 있는 결과를 얻는데 중요하다. 정량분석 결과는 표준물질을 동시에 분석하여 생성된 검량선을 사용하여 얻는다.

다당류 및 당단백질 당사슬의 가수분해

크로마토그래피 방법으로 단당류 구성 요소의 확인 및 정량을 하기 위해서는 분석 전에 시료를 가수분해해야 한다. 또한 적절한 시료 준비 과정이 필요한데 그 이유는 부형제 또는 공정 관련 불순물이 당류일 수 있고 잔류염이 가수분해, 크로마토그래피 분리 또는 형광 표지를 방해할 수 있기 때문이다. 시알산 잔기는 약산 가수분해 또는 효소 처리에 의해 유리될 수 있는데 이 과정은 펩타이드 골격에 부착된 다른 당 잔기들도 유리시킨다. 당의 정량을 위해 가수분해 전 또는 후에 내부 표준물질이 첨가된다. 강염기 음이온 교환 크로마토그래피법에 의한 시알산 분석 시 가장 일반적으로 사용되는 표준품은 3-deoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid(KDN)이고, 2-deoxyglucose는 중성당 분석에 널리 사용된다. 그런데 이러한 당류 표준물질은 산에 약하기 때문에 가수분해 단계 후에 첨가되어야 한다. 정확한 정량에는 화학량론적 가수분해와 가수분해 중 단당류 분해산물 생성이 둘다 영향을 준다.

총 시알산량 결정

시알산은 일반적으로 뉴라민산의 N-아세틸 및 N-글리코릴 유도체(Neu5Ac 및 Neu5Gc) 형태로 세균의 다당류 및 당단백질에서 발견된다. 시알산은 산 가수분해에 의해 다른 단당류와 함께 유리된 후 적절한 표준품 혼합물을 사용한 HPLC 분석에 의해 정량 분석된다. 또한 총 시알산량은 가수분해 없이 비색법에 의해 결정될 수도 있다. 워렌(Warren)법이라 불리는 비색법의 경우에는 당단백질로부터 유리된 뉴라민산의 요오드산화 반응(periodate oxidation)산물과 티오바비투르산(thiobarbituric acid, TBA)의 반응에 의해 발색이 일어나며 또 다른 비색법에서는 뉴라민산과 레조르시놀(resorcinol)의 반응이 발색에 관여한다. 그리고 정확한 정량을 위해 각각의 측정에 표준물질이 필요하다.

시알산의 선택적 유리

약산 가수분해 또는 효소 분해는 당단백질의 당사슬로부터 선택적으로 시알산을 유리시켜 크로마토그래피법으로 정량분석을 하고자 할 때 그리고 Neu5Gc와 같은 원치 않는 단당류를 정량분석하고자 할 때 사용될 수 있다. 크로마토그래피 분석 전에 중성당과 아미노당을 유리하기 위해서는 더 강한 산성 조건이 필요하다. 당 분해 조건은 분석하고자 하는 개별 단백질에 맞게 최적화되어야 한다.

원당단백질으로부터 시알산의 유리를 위한 뉴라미니데이즈 소화

여러 종류의 뉴라미니데이즈가 분리 및 연구되어왔다. Clostridium perfringens 유래의 효소는 당단백질로부터 시알산을 유리시키는데 가장 일반적으로 사용되는 효소이다. 또한 관련 재조합 효소도 상용화되어 있다. 특이성이 다른 효소들을 구입할 수 있기 때문에 이를 사용하여 결합 유형을 구별할 수도 있다. 결합 유형과 Neu5Ac 및 Neu5Gc에 따라 동력학적 특성이 달라지기 때문에 가수분해 조건은 각 제품별로 최적화되어야 한다. 유리된 당사슬로부터 Neu5Acα2→,3-결합과 Neu5Acα2→,6-결합을 선택적으로 제거하는 것은 결합 유형을 구별하는 매우 편리한 수단이다. 그리고 정량분석을 위해 가수분해 및 산 제거 후, 2-데옥시글루코오스와 같은 적절한 내부 표준물질을 정해진 양만큼 첨가한다.

표지되지 않은 단당류의 분리 및 정량

HPAEC-PAD 분석법은 가수분해 산물에 존재하는 표지되지 않은 단당의 명명 및 정량분석을 동시에 수행할 수 있는 유일한 방법이다. HPAEC-PAD 분석법은 올리고당 분리에도 사용할 수 있어 하나의 방법으로 두 가지 목적의 분석을 수행할 수 있다.

HPAEC-PAD 분석법은 유도체화 없이 단당류 및 올리고당 분석이 가능하다. 탄수화물은 다가 화합물이기 때문에 12-14의 pKa 값을 갖는 약산이며, 높은 pH에서는 중성 탄수화물조차도 이온화됨으로 이온교환크로마토그래피법에 의해 분리가 가능하다. 비록 탄수화물이 알칼리에서도 안정한 다공성 음이온 컬럼(폴리스티렌-디비닐벤젠으로 만들어짐)에 의해 분리될 수 있지만 확산 문제 때문에 퍼진 모양의 피크를 만드는 경향이 있다. 마이크로비드 박막형 음이온 교환 칼럼 충진물에서는 다공성인 작은 라텍스 비드(직경 0.1 μm 이하)가 무공성인 큰(직경 10 μm 이상) 비드에 부착되어 있다. 이런 구조의 충진물에서는 탄수화물 분자들이 라텍스 마이크로 비드 표면의 작용기와 상호 작용하면서 확산과 피크 퍼짐이 억제된다.

PAD는 HPAEC가 기본적으로 제공하는 pH가 높은 용액에 의존하므로 HPAEC를 활용한 탄수화물의 검출에 적합하다. PAD는 작동 전극 표면에서 분석대상 분자의 산화 또는 환원으로 인한 발생하는 전류 또는 전하를 측정한다. 전자는 산화 반응 시에 분석대상 분자로부터 전극으로 전달되며 환원 반응 시에는 반대 방향으로 전자 전달이 일어난다. 이 과정은 산화 또는 환원될 수 있는 분석물질에 대해 민감하고 매우 높은 선택성을 보이지만 전기적 활성이 없는 분자종은 검출할 수 없다. 탄수화물은 높은 pH 조건에 있는 금 및 백금 전극에서 쉽게 산화되며 이때 발생한 전류는 탄수화물의 농도에 비례한다.

전형적인 전류검출기(amperometric detection system)는 작동 전극과 기준 전극을 포함한다. 금 전극은 탄수화물 분석에 가장 일반적이지만 산화 생성물은 전극 표면을 부식시켜서 더 이상의 산화를 어렵게 한다. 따라서 안정적인 활성 전극 표면을 유지하기 위해 양/음 전위 간 주기적인 펄스를 가해준다. 이와 같은 상이한 전위의 시계열을 파형이라 하며 파형을 반복적으로 적용하는 것이 PAD의 기본 원리이다. 파형은 HPAEC-PAD법 마다 그리고 작동 전극 마다 다르다. 일회용 금 전극은 빠른 사중 파형의 사용을 필요로 하나 다른 금 전극은 전극 표면을 손상시키지 않고 더 넓은 범위의 파형을 사용할 수 있다. 일회용 전극 및 빠른 파형은 단당류 정량분석 시 감도 및 정밀도에 대한 전극 불활성화 시간의 영향을 최소화하기 위해 도입되었다.

분리 및 정량 전 단당류의 형광 표지

가수분해 산물에 존재하는 단당류를 명명 및 정량하는 또 다른 방법은 검출이 용이한 형광 표지물질을 환원적 아민화를 통해 단당류에 결합시키는 것이다. 이러한 방법은 검출 감도를 높이고 크로마토그래피법에 의한 단당류 분리도를 개선시킨다. 형광 표지를 통한 단당류 분석은 표준적인 HPLC 장비가 사용될 수 있고 동일한 표지법을 유리 올리고당에도 적용할 수 있기 때문에 하나의 분석법을 두 가지 목적에 활용할 수 있다. 그러나 형광 표지법은 단당류의 명명 및 정량에 있어서 HPAEC-PAD 보다는 덜 일반적이다. 시알산 유도체의 표지에는 대개 페닐렌디아민(1,2-phenylenediamine) 또는 메틸렌디옥시(4,5-methylenedioxy, DMB) 유도체가 사용되며 표지된 생성물은 C-18 칼럼으로 분리하고 형광검출기로 측정된다.

자료의 평가와 분석

당사슬분석을 위한 분석 방법으로 얻어진 자료는 세 가지 다른 목적을 위하여 분석 및 평가될 수 있다.

1) 구조 또는 구조군의 명명

2) 정성적 요건을 사용한 시험물질의 적합성 확인

3) 정량적 요건을 사용한 시험물질의 적합성 확인

구조 또는 구조군의 명명

당사슬분석법에서의 분석 대상은 단당류 구조(예; 시알산, 푸코오스), 올리고당 구조(예; 4개의 시알산을 가진 4가지-안테나형 당사슬) 또는 공통적인 속성을 공유하는 구조군(예, 4개의 시알산을 가진 이성질체, 3가지-안테나형 이성질체)일 수 있다. 분석 대상의 명명은 자료를 분석하고 평가하는데 있어서 필수 단계인데 측정값에 직접 근거하거나 적절한 표준품과의 비교분석을 통해 이루어질 수 있다.

직접 명명

당사슬 구조에 대한 직접 명명(absolute assignment)은 일반적으로 제품 개발 단계에서 이루어지지만 반듯이 일상적인 분석 항목일 필요는 없다. 이 방법은 측정값에 직접 근거하여 구조명을 지정한다. 이것은 다단계 과정을 필요로 할 수 있으며 이것에는 효소 및 화학 반응, 분리 과정, 온라인/오프라인 검출 과정 등이 포함된다. 일반적으로 구조 지정을 위한 근거로는 질량 대 전하비(charge-to-mass ratio)가 사용된다.

비교를 통한 명명

분석 대상의 구조는 분석과정 또는 시스템 적합성 표준물질과의 비교를 통해 확인될 수 있다. 이때 표준물질은 특성이 잘 확인된 당단백질(시험물질과 같은 종류일 수 있음, 예; 복잡한 구조의 N-당단백질에 대해 페튜인) 또는 특성이 잘 확인된 시험물질의 또 다른 배치로부터 만들어질 수 있다.

이 방법을 통한 구조 명명 시에는 다음 사항들이 고려될 수 있다.

1) 머무름 시간의 높은 재현성이 검증된 경우에는 구조 지정을 위해 머무름 시간 절대값이 사용될 수 있다.

2) 대안으로 당사슬 마커를 시험 과정의 시작과 끝에 주입하여 머무름 시간의 변동을 확인할 수 있다. 이러한 표준 크로마토그램을 바탕으로 검체의 당사슬이 지정될 수 있다.

3) 당사슬 지정을 위해 사용될 수 있는 표준물질이 없는 경우, 머무름 시간의 절대값 또는 정규화된 값이 당사슬 피크를 모니터하고 표지하기 위해 사용될 수 있다.

정성적 요건을 사용한 시험물질의 적합성 확인

검체에 대한 분석 결과가 규격에 적합한지 여부가 평가된다. 이 과정은 보통 시험물질과 동시에 시험한 표준물질의 분석 결과와 비교함으로써 이루어진다. 데이터 평가를 위해 다음 사항이 필요하다.

1) 표준품을 사용하여 얻어진 분석 결과는 기댓값과 비교하여 시스템 적합성이 확인될 것. 예를 들어, 당사슬 프로파일 작성 시험의 경우, 표준물질로부터 얻어진 프로파일을 표준 프로파일과 비교하여 모든 시스템 적합성 기준이 충족됨이 입증되어야 함

2) 표준물질 및 검체부터 얻어진 프로파일 간 유사성이 각조에 명시된 적합성 기준을 사용하여 입증될 것

정량적 요건을 사용한 시험물질의 적합성 확인

분석물 수준의 정량과 결과 표현

시알산 또는 다른 단당류를 정량하는 경우, 데이터는 시알산과 당단백질의 몰비로 표현될 수 있다. 이때 데이터는 시알산에 대한 표준품과 단백질 함량 결정 방법을 참조하여 계산된다.

분리 프로파일의 정량적 표현

프로파일 또는 분포 패턴도 여러 방법을 통해 수적으로 표현될 수 있는데 이것에는 정규화 과정도 포함된다. 각 분석 대상의 퍼센트 함량, 예를 들어 특정 당사슬 구조의 함량이 전체 당사슬 구조들의 측정값에 대한 퍼센트로 계산될 수 있다. 또한 방법-특이적이거나 제품 특이적이며 특정 각조에서만 정의되는 Z값과 같은 수치도 분석 대상들의 프로파일을 정량적으로 표현하는데 사용될 수 있다.

표준품

당사슬분석에서 표준품은 두 가지 기능 즉 즉 시스템 적합성 및 검체의 적합성 확인을 수행한다. 시스템 적합성 확인에 사용되는 표준품은 다음과 같다.

1) 시험물질에 대한 표준물질

2) 특성이 잘 확인된 표준물질로부터 분리한 당사슬

3) 당단백질(예, 페튜인, IgG)로부터 유리된 특성이 잘 확인된 당사슬

4) 확인 및 순도시험을 위해 사용되는 당사슬 마커

시험하고자 하는 당단백질의 적합성 확인을 위해 사용되는 표준물질은 시험물질과 동일하게 제조될 수 있다. 또한 특정 각조에 기술된 당사슬분석 절차는 해당 시험물질에 대한 표준물질 사용과 분석법의 검증을 요구한다.

분석법 개발 시 고려사항

이 절은 분석법을 개발하는 과정에서 실제로 실행하게 되는 절차들을 다루고 있다. 분석법 개발 및 검증의 범위는 분석하고자 하는 제품에 따라 달라질 수 있다. 선택된 분석법 범위에 따라 여러 단계들이 필요하게 되며 예를 들면 다음과 같다.

1) 당단백질의 분리와 정제(또는 탈염)

2) 단백질 골격으로부터 N-또는 O-당사슬을 선택적으로 유리시키는 효소적(또는 화학적) 처리

3) 유리된 당사슬의 분리와 정제

4) 유리된 시알산과 단당류 잔기의 확인

5) 유리된 당사슬의 발색단 표지

6) 비표지 또는 형광 표지된 당사슬의 분리

7) 당사슬 명명 및 정량

8) 당사슬 및 비당사슬 펩타이드 비교분석을 통한 당사슬 결합 위치 결정

단백질 분리와 정제

매트릭스로부터 당단백질의 분리와 정제는 모든 간섭 물질(예, 첨가제 및 염)을 제거하기 위하여 필요하며, 필요한 경우 각조에서 더 자세히 언급될 것이다. 그리고 이 과정은 단백질의 정량적 회수를 보장하기 위하여 재현 가능한 방법으로 실행되어야 한다.

올리고당의 유리와 분리

당사슬 유리를 위해 선택되는 방법은 시험하는 단백질에 따라 다르며 당사슬 결합의 형태(예 N-또는 O-당사슬 결합)에 기초한다. 당사슬 유리를 위한 비공정서 시험법들은 모든 당사슬들의 정량적 검출을 보장할 수 있도록 최적화되어야 한다. 예를 들어 유리 효율에 영향을 주는 요소들인 효소 대 단백질 농도비, 온도, 반응시간 경로 및 분해 전 단백질 변성 등이 최적화되어야 한다. 효소/화학 반응이 당사슬 조성을 변화시켜서는 안 된다. 예를 들어 시알산 잔기를 파괴시켜서는 안 된다는 점은 명심할 필요가 있다. 또한 한 개 이상의 당사슬 결합 부위가 있는 경우, 효소 처리는 단백질 구조나 결합 위치와 상관없이 모든 올리고당을 비례적으로 유리시켜야 하며 모든 당사슬 부위들이 재현성 있게 회수됨이 확인되어야 한다.

유리된 당사슬의 유도체화

유도체화는 일반적으로 표준시험법이 없다. 그러므로 모든 당사슬에 대한 유도체화 방법의 재현성 여부는 확인되어야 한다. 이것은 유도체화 시약의 양, 반응 온도 및 반응 시간과 같은 반응조건의 최적화를 통해 이루어진다. 유도체화 반응은 시알산 잔기 파괴와 같이 당사슬 조성을 변화시킬 수 있는 반응을 일으켜서는 안 된다.

분리, 동정 및 시스템 적합성

당사슬분석을 위하여 사용되는 방법들은 신뢰성 있는 동정(명명)과 정량을 보장할 수 있도록 당사슬을 분리 및 검출할 수 있어야 한다. 따라서 시스템 적합성 기준은 결과 값에 영향을 주는 핵심적인 파라미터와 관련이 있어야 한다. 같은 조건에서 수행된 시험물질과 표준품간 당사슬 프로파일 비교는 분석 절차의 올바른 실행을 평가하는 지표이다. 얻어진 결과을 더 검증하기 위해 종류가 다른 분석법으로 반복 시험을 할 수도 있다. 표준품(예, 검체에 대한 표준물질, 시스템 적합성 당사슬 마커)을 사용하는 것은 분석 절차의 검증 및 시스템 적합성 파라미터 확립에 필수적이다. 당사슬 프로파일의 정량적 표현(예, Z 값 추정)의 재현성도 검증되어야 한다.

당사슬 결합 및 비결합 펩타이드간 비교분석을 통한 당사슬 자리 결정

점유가 효소로 분해한 당단백질로부터 생성된 당사슬 결합 및 당사슬 비결합 펩타이드 간 비교를 통해 당사슬 결합 자리를 추정할 수 있다. 이때 효소 분해반응의 재현성이 입증되어야 한다.

용어

· CE : Capillary Electrophoresis (모세관전기영동법)

· DMB : 4,5-methylenedioxy (메틸렌디옥시)

· EGF : Epidermal Growth Factor (표피 성장 인자)

· GalNAc : N-Acetyl-D-galactosamine (N-아세틸-D-갈락토사민)

· Galβ1, 4GlcNAc : N-acetyllactosamine (N-아세틸락토사민)

· GlcNAc : N-Acetylglucosamine (N-아세틸글루코사민)

· HPAEC-PAD : High Performance Anion-Exchange Chromatograph-PAD     (알칼리성 음이온교환크로마토그래피법)

· ICH : International council for Harmonization Technical of Requirement    for Pharmaceuticals for Human use (국제의약품규제조화위원회)

· IEF : IsoElectric Focusing (등전점전기영동법)

· KDN : 3-deoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid (3-데옥시–D-     글리세로-D-갈락토-2-노눌소닉산)

· LC : Liquid Chromatography (액체크로마토그래피법)

· LC-MS : Liquid chromatography Mass spectrometry (액체크로마토그    래피–질량분석기법)

· MS : Mass Spectrometry (질량분석법)

· Neu5Ac : Sialic aicd, N-Acetylneuraminic aicd (시알산, N-아세틸뉴라민산)

· Neu5GC : N-glycolylneuraminic acid (N-글리콜릴뉴라민산)

· PAD : Pulsed amperometric detection (펄스형 전류검출기)

· PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis (폴리아크릴아마이드겔 전기영동법)

· PGC : Porous Graphitic Carbon high performance liquid chromatography    (다공성 흑연크로마토그래피법)

· PNGase F : Peptide N-glycosidase F (PNGase F 효소방법)

· SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis    (도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔전기영동법)

· SPE : Solid Phase Extraction (SPE 카트리지)

· TBA : Thiobarbituric acid (티오바비투르산)

재조합 단클론항체의약품 품질분석 시험법

본 일반정보에서는 마우스, 키메라(chimeric) 및 인간화 IgG형 단클론항체 및 아형(예, IgG1, IgG2, IgG4)에 대한 분석 시험법을 소개한다.  아형은 아미노산 서열과 이황화 결합(disulfide bond) 수에 차이를 보이며, 경우에 따라 아형에 특이적인 분석법이 필요하다. 본 일반정보는 치료와 예방목적의 항체의약품 및 진단 목적의 단클론항체에 적용되며, 의약품 제조시 시약으로 사용되도록 규제 기관에 의해 지정된 단클론 항체에는 적용되지 않는다.

혈청 또는 혈장에서 자연적으로 존재하는 다클론항체는 면역계의 일부로서 여러 표적과 결합할 수 있다. 이와 대조적으로 사람에 적용되는 치료 목적의 단클론항체는 단일 클론 세포에서 유래하며, 특정 표적에만 결합하는 특이성을 갖는 면역글로불린(혹은 면역글로불린의 단편) 제제이다. 치료용 단클론항체는 일반적으로 수용성 항원(리간드)에 결합하여 이를 중화시킴으로써, 리간드가 관련 수용체에 결합하는 것을 차단하는 작용 기전 을 갖는다. 그러나 다른 종류의 치료용 단클론항체의 경우 세포 표면 항원을 인식하여 결합할 수 있는데, 이러한 경우 항체의 Fc(fragment crystallizable) 부위를 매개로 한 기능을 통해 면역반응에 관여하기도 한다. 일반적으로 단클론항체는 하나의 항원에 대해 결합 특이성을 가지고 있지만, 유전자재조합을 통해 2개의 서로 다른 표적(항원)과 결합할 수 있는 이중 특이적 단클론항체도 제조될 수 있다. IgG형 단클론항체는 약 150 kD의 분자량을 가지며, 각 항체 분자는 두 개의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드로 구성되는데, 중쇄와 경쇄의 분자량은 각각 약 50 및 25 kD이다. 항체는 이황화 결합으로 연결된 Y자 모양을 취하며, Y자의 각 팔 부분은 Fab(fragment antigen-binding) 도메인, Y자의 줄기는 Fc 도메인으로 불린다. 또한 단클론항체는 당단백질로서, Fc 도메인에 당사슬 결합 부위를 가지며, 분자에 따라 Fab 도메인에 추가적인 당사슬 결합 부위를 가지기도 한다.

단클론항체의 특이성은 Fab 도메인에 위치한 항원 결합 부위에 의해 결정된다. Fc 도메인은 항체-의존 세포 독성 및 보체-의존 세포 독성과 관련된 수용체 결합 부위를 가지고 있다.

단클론항체는 마스터 세포 은행 (master cell bank) 및 제조용 세포 은행 (working cell bank)에 기반한 시스템을 통해 생산되며 생산된 항체는 회수 후, 정제 과정을 통해 제조 공정 관련 불순물을 허용 기준까지 제거하게 된다.

현재 허가된 단클론항체 의약품은 효과기 세포(effector cells) 활성화, 세포 괴사, 가교 결합에 의해 유도되는 세포 사멸, 길항제(antagonist) 작용 또는 작용제(agonist) 기능 등을 통해 효능을 나타낸다.

본 일반정보에서는 크기배제크로마토그래피(size-exclusion chromatography, SE-HPLC, SEC), 모세관 전기영동, 올리고당 분석 등을 통한 순도 평가를 다룬다.

본 내용은 주로 IgG형 단클론항체에 대한 것이나, 기재된 시험법의 원리는 IgM 또는 기타 다른 형태의 항체, 항체 단편 및 Fc-융합 단백질 등에도 적용할 수 있다. 또한 항체에 화학물질을 결합시킨 경우, 변형 전 항체에도 본 시험법을 적용할 수 있다.

다른 한편 소개될 시험법이 단클론항체 분석에 있어 절대적인 것은 아니며, 만약 다른 시험법이 정확성, 감도, 정밀성, 선택성, 자동화 및 자료 디지털화에서의 적합성, 또는 기타 특수한 상황에서 장점을 가진다면 이를 사용할 수 있다. 물론 이러한 시험법은 적절한 밸리데이션을 통해 기존 시험법과 비교하여 동등하거나 그 이상의 결과를 얻을 수 있음이 입증되어야 한다.

1. 크기배제 크로마토그래피

크기배제크로마토그래피법(size exclusion chromatography, SEC)은 단량체 및 고분자 종(HMWS, 응집체) 측정에서는 좋은 완건성을 보이지만, 저분자 종 (LMWS, 단편)에 대한 정량성은 단클론항체에 따라 매우 다양하다. LMWS의 정량은 모세관 SDS-전기영동법(CE-SDS)이 더 좋은 결과를 얻을 수 있다.

이동상: 인산이수소칼륨(dibasic potassium phosphate) 10.5 g, 인산일수소칼륨(monobasic potassium phosphate) 19.1 g 및 염화칼륨(potassium chloride) 18.6 g을 물에 첨가하여 녹이고, pH를 6.2 ± 0.1로 맞춘 후 부피를 최종적으로 1 L로 맞춘다. 이 액을 0.45 um 필터로 여과한다.

시스템 적합성 용액: 공인된 단클론 IgG 시스템 적합성 표준품 한 바이알에 이동상 200 μL를 첨가하여 재용해시켜 10 mg/mL  용액을 준비한다. 제조한 시스템 적합성 용액은 24시간 이내에 사용해야 하며, 즉시 사용하지 않을 경우 2 ℃–8 ℃에 보관해야 한다.

시스템 적합성 공시험액: 이동상을 사용한다.

검액: 검체를 이동상으로 10 mg/mL 농도로 희석하여 준비한다.

공시험액: 검체에서와 동일한 비율로 제형버퍼를 이동상으로 희석하여 준비한다.

기기 분석 조건

- 방법: LC

- 검출기: UV 280 nm

- 컬럼: 7.8 mm × 30 cm; 5 μm (5 ∼ 7000 kDa 범위의 단백질 분리용 칼럼, 친수성으로 코팅된 직경 1.5 ∼ 10 μm의 실리카 또는 복합 재질의 충진제)

- 온도

컬럼: 상온

자동시료주입기: 2 ℃–8 ℃을 유지

- 유속: 0.5 mL/분

- 주입량: 20 μL

- 실행 시간: 30분

시스템 적합성 기준

- 시스템 적합성 용액의 크로마토그램은 공인된 단클론 IgG 시스템 적합성 표준품 인증서에 제시된 전형적인 크로마토그램과 일치해야 한다.

[참고: 중합체, 이량체, 단량체 및 LMWS의 유지시간(retention time)      은 각각 약 12, 15, 18 및 22분이다.]

- 검액의 주입 전후에 브라켓팅으로 주입한 시스템 적합성 표준액의 크로마토그램 프로파일은 서로 일치하여야 하며, 각각은 공인된 단클론 IgG 시스템 적합성 표준품 인증서에 제시된 전형적인 크로마토그램과 일치해야 한다.

- 시스템 적합성 용액 내 HWMS 피크 면적의 백분율은 0.4 % ∼ 0.67 %이어야 한다.

- 시스템 적합성 용액 내 주피크 면적의 백분율은 99.1 % ∼ 99.6 %이어야 한다.

- 시스템 적합성 용액 내 LMWS 피크 면적의 백분율은 0.2 % 이하         (NMT)이어야 한다.

분석: 검액 주입 전후에는 최소한 한 번 이상의 시스템적합성 용액을 주입해야 한다(브라켓팅). 최종 시스템적합성 용액 주입 전에 마지막으로 공시험액을 주입하는 순서를 포함해야 한다.

계산: 적절한 전자식 적분기 또는 컴퓨터 시스템을 사용하여, 브라켓팅으로 주입된 시스템 적합성 용액을 분석한다. 공시험액에서 나온 피크는 적분에서 제외하며, 주피크 이전에 용출되는 단백질 관련 피크는 HMWS로, 주피크 이후에 용출된 단백질 관련 피크는 LMWS로 분류된다. HMWS, 주피크 및 LMWS의 피크 면적 비율을 보고한다.

2. 환원 및 비환원 모세관 SDS 전기영동법

모세관 SDS 전기영동법(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate, CE-SDS)은 비 당화물, 반쪽 항체 및 항체 단편과 같은 제품에서 유래된 불순물의 정량에 사용되는 감도 높은 분석 방법으로, 안정성 평가 시험에도 유용하다. 검체를 SDS로 변성시킨 후, 비환원 조건하에서는 완전한 항체, 환원 조건하에서는 경쇄(LC) 및 중쇄(HC) 분석이 가능하다.

[참고: 각 항체의 안정도에 따라 시료 준비에 차이가 있을 수 있다. 예를 들러 70 ℃ 에서 15분 처리 시 특정 항체의 단편화 또는 이황화 결합을 손상시킨다면 처리 시간을 조정한다]

SDS 시료 완충액: pH 8.95±0.05의 100 mM Tris-HCl 및 1 % (w/w)의 SDS를 포함하는 용액을 준비한다.

SDS 겔 완충액: 0.2 % (w/w) SDS 및 적절한 겔을 포함하는 pH 8.0의 완충액

알킬화 용액: 물에 녹인 250 mM Idoacetamide를 사용하기 직전에 준비한다.

시스템 적합성 용액: 공인된 단클론 IgG 시스템적합성 표준품 1 바이알을  0.5 mL의 주사용수로 녹여 최종 농도가 4 mg/mL가 되도록 한다.

내부 표준 용액: 0.5 % (w/w) SDS 및 0.2 % (w/v)의 sodium azide를 함유하는 물에 10 kDa의 내부 표준 물질을 녹여 5 mg/mL로 준비한다.

비환원 시스템 적합성 용액: 시스템 적합성 용액 25 μL와 내부 표준 용액 4 μL를 혼합한다. SDS 시료 완충액 66 μL와 알킬화 용액 5 μL를 혼합한다. 이 두 혼합액을 섞은 후, 70 ℃에서 15분 간 가열한다. 실온에서 3분 간 냉각시키고, 300 × g로 1분 간 원심 분리한 후, 100 μL를 자동시료주입기 바이알로 옮긴다.

환원 시스템 적합성 용액: 시스템 적합성 용액 25 μL와 시료 완충액 66 μL를 혼합한다. 여기에 내부 표준 용액 4 μL 및 β-mercaptoethanol 5 μL를 첨가한다.  완전히 섞은 후, 혼합액을 70 ℃에서 15분 간 가열한다. 실온에서 3분 간 냉각시키고, 300 × g로 1분 간 원심 분리한 후, 100 μL를 자동시료주입기 바이알로 옮긴다.

[참고: 환원제로 β-mercaptoethanol 대신에 DTT(dithiothreitol)를 사용하는 경우도 있다. 이때 사용량은 최적화되어야 한다]

공시험액: 물 45 μL와 SDS 시료 완충액 50 μL을 혼합한다. 이 용액에, 환원 조건의 경우 내부 표준 용액 4 μL와 β-mercaptoethanol 5 μL를 첨가하고, 비환원 조건의 경우 내부 표준 용액 4 μL와 알킬화 용액 5 μL을 첨가한다. 완전히 섞은 후, 혼합액을 70 ℃에서 15분 간 가열한다. 실온에서 3분 간 냉각시키고, 300 × g로 1분 간 원심 분리한 후, 100 μL를 자동시료주입기 바이알로 옮긴다.

비환원 검액: 검체 100 μg을 SDS 시료 완충액 50–95 μL에 희석하여 최종 부피가 95 μL가 되도록 한다. 여기에 내부 표준 용액 4 μL 및 알킬화 용액 5 μL를 첨가한다. 완전히 섞은 후, 혼합액을 70 ℃에서 15분 간 가열한다. 실온에서 3분 간 냉각시키고, 300 × g로 1분 간 원심 분리한 후, 100 μL를 자동시료주입기 바이알로 옮긴다.

환원 검액: 검체 100 μg을 SDS 시료 완충액 50–95 μL에 희석하여 최종 부피가 95 μL가 되도록 한다. 내부 표준 용액 4 μL와 β-mercaptoethanol 5 μL를 첨가한다. 완전히 섞은 후, 혼합액을 70 ℃에서 15분 간 가열한다. 실온에서 3분 간 냉각시키고, 300 × g로 1분 간 원심 분리한 후, 100 μL 를 자동시료주입기 바이알로 옮긴다.

기기 분석 조건

- 방법: CE-SDS

- 검출기 : UV 또는 Diode array 220 nm

- 모세관 : 융합 실리카 모세관(내경 50 ㎛)은 유효길이가 20 ㎝ 되도록     30 ㎝ 길이로 자른다. 각 실행 단계마다 다음과 같은 전처리 및 사전      충전 단계가 필요하다.

- 온도

검체 보관: 약 25 ℃

모세관: 약 25 ℃

- 모세관 전처리: 0.1 N 수산화나트륨을 이용하여 70 psi로 3분간 씻어주     고, 0.1 N 염산을 이용하여 70 psi로 1분간 씻는다. 그 다음 물로 70       psi로 1분간 씻는다.

- 모세관 사전 충전: SDS 겔 완충액으로 70 psi에서 10분 동안 헹군다.

- 검액 주입: Electrokinetic 주입, 5.0 kV 역상 극성으로 40분간 실시

- 전압 분리

비환원 조건: 15 kV에서 역상 극성으로 40분간 실시

환원 조건: 15 kV에서 역상 극성으로 40분간 실시

시스템 적합성 기준

(1) 환원 조건

- 환원 시스템 적합성 용액의 전기영동도는 공인된 단클론 IgG 시스템 적합성 표준품 인증서에 제시된 전형적인 전기영동도와 일치하여야 한다.

- 중쇄와 비당화 중쇄의 주피크가 명확하게 식별될 수 있어야 한다. 비당화 중쇄와 중쇄 사이의 분리도는 1.2 이상이다.

- 비당화된 중쇄 피크 면적을 모든 중쇄 피크의 합으로 나누고 100을 곱하여 중쇄의 비당화 비율을 구한다. 환원 시스템 적합성 용액에서 전체 중쇄의 비당화 비율은 0.75 %–1.34 % 내에 있어야 한다.

(2) 비환원 조건

- 비환원 시스템 적합성 용액의 전기영동도는 USP monoclonal IgG 시스    템 적합성 표준품 인증서에 제시된 전형적인 전기영동도와 일치하여야 한다.

- 주피크가 명확하게 식별될 수 있어야 한다. IgG 주피크와 단편 1         (Fragment 1, F1) 간의 분리도는 1.3 이상(NLT)이다.

- 내부 표준물질 피크와 모든 시스템 피크를 제외하고, IgG 주피크의 시    간보정된 피크 면적을 모든 시간 보정된 피크 면적의 합으로 나눈 뒤     100을 곱하여 주피크의 상대적 양을 구한다.  시스템 적합성 용액 내      IgG 주피크의 상대량은 61.4 %–86.4 % 범위 내에 있어야 한다.

- 브라케팅 공시험액의 내부 표준물질의 이동에 대한 상대 표준 편차는    2 % 이하이어야 한다. 내부 표준물질이 검출된 후 어떠한 다른 피크도    검출되지 않아야 한다.

분석

공시험액, 시스템 적합성 용액, 검액을 분석한다.

[참고: 기기 조건에 따라, 시스템 적합성을 만족할 수 있도록 모세관에 가해지는 전기장 및 검체 주입 조건을 조정할 수 있다.]

두 개의 완충액 저장 용기 내의 전해질로 SDS 겔 완충액을 사용하여 40분 동안 500 V/cm (역상 극성)의 전기장을 가한다. 20 초간 역상 극성 및 5.0 kV에서 검액을 주입하여 모세관의 양극 쪽으로 이동시키고, 220 nm에서의 전기영동도를 기록한다. 0.1 N 수산화나트륨을 이용하여 70 psi로 3분간 씻어주고, 0.1 N 염산을 이용하여 70 psi로 1분간 씻는다. 그 다음 물로 70 psi로 1분간 씻는다. 최소 두 번 반복하여 주입한다. 내부 표준 물질 피크 이후에 이동하는 모든 피크의 시간 보정 피크 면적을 계산한다.

환원 조건: 중쇄, 비당화된 중쇄, 경쇄의 시간 보정된 피크 면적의 합을 내부 표준 물질 피크 이후에 나타나는 시간 보정된 모든 피크 면적의 합으로 나누고 100을 곱하여 검액 피크의 상대적인 양을 계산한다.

비환원 조건: IgG 주피크의 시간 보정된 피크 면적의 합을 내부 표준액 이후에 나타나는 시간 보정된 모든 피크 면적의 합으로 나누고 100을 곱하여 검액 피크의 상대적인 양을 계산한다.

3. 올리고당 분석-단클론항체의 N-결합 올리고당

단클론항체 원료의약품에 대한 기준에 올리고당 분석을 포함시키는 것은 제품별로 결정되어야 한다. 다음 분석 방법 중 하나 이상을 사용하여 올리고당 프로파일의 확인 또는 정량 분석을 할 수 있으며 당사슬 분리방법, 표지 방법, 검출 방법 등에서 차이가 나는 검증된 다른 분석법도 사용될 수 있다.

[참고: Fc 및 Fab 모두에 N-결합 올리고당이 존재하는 단클론항체의 경우, 당사슬 결합 자리 확인을 위해 추가적인 검액 전처리 과정(예: 파파인과 같은 효소 처리)을 통해 도메인을 분리하기 하여야 한다. 이때 추가적인 검액 준비 단계는 검증이 필요하다.]

[참고: 올리고당의 허용 기준은 개별 당사슬에 대해 규정될 수 있으며 이때 제품의 과거 배치 분석 자료 등 제품 특이적 정보가 활용될 수 있다.]

가. 방법 A: 레이저 유도 형광검출법을 이용한 모세관 전기영동

실행 완충액: 물 80 mL에 트리에탄올아민 (triethanolamine, TEA) 1.492 g과 글리세롤 10 g을 녹여 pH 7.5의 100 mM 트리에탄올아민 및 10 % 글리세롤을 준비한다. 1 N 염산을 사용하여 pH 7.5로 맞추고, 최종 부피가 100 mL가 되도록 물로 희석한다.

시료 완충액: 실행 완충액 1 mL를 물 9 mL로 희석한다.

효소 반응 완충액: 50 mM 인산나트륨, pH 7.5

APTS 표지 시약: 8-아미노파이렌-1,3,6-트리술폰산 (8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate,APTS) 5 mg을 15 % 아세트산 48 μL에 녹여 잘 섞는다.

검액: 검체 50 μg에 PNGase F(5 Unit/mL) 2 μL를 가하고 효소 반응 완충액으로 50 μL가 되도록 맞춘다.

[참고: PNGase F의 Unit 정의는 제조사마다 다르므로 검체에서 N-결합 당을 완전히 분리시키기 위해 필요한 효소양은 실험적으로 확인할 필요가 있다.]

37 ℃에서 18시간 처리한다. 10000 분자랑 컷오프(molecular-weight-cut-off, MWCO) 원심분리 필터를 이용하여 원심분리하여 떨어진 올리고당을 분리하며, 원심 진공 건조기에서 건조시킨다. 건조 된 올리고당에 APTS 표지 시약 2 μL와 1 M 나트륨 시아노보로하이드리드(sodium cyanoborohydride) 2 μL를 첨가한다. 55 ℃에서 90분 간 처리 후, 반응물과 혼합물의 반응을 종료시키기 위해 물 46 μL를 첨가한다. 시료 완충액 95 μL에 ATPS 라벨링 검체 5 μL를 넣는다.

시스템 적합성 용액: 물 50 μL에 당사슬 표준품(10 μg)을 재현탁하고, 볼텍스 믹서로 혼합한다. 초소형 원심분리 튜브에 당사슬 표준품 (1 μg) 5 μL를 넣는다. 상온에서 원심 진공 건조기를 사용하여 당사슬 표준품을 건조시킨다. 각 표준품에 1 M 나트륨 시아노보로하이드리드(sodium cyanoborohydride) 2 μL를 첨가하고, APTS 표지 시약 2 μL를 첨가한다. 볼텍스 믹서로 혼합하고 액체를 침전시키기 위해서 짧게 원심분리 한다. 55 ℃에서 90분동안 처리하고 물 46 μL를 넣어 반응을 종료시킨다. 표준품은 –20 ℃에서 5주까지 보관 가능하다.

기기 분석 조건

- 방법: CE

- 검출기: 레이저 유도 형광 검출기 (488 nm 여기 [excitation] 파장; 520     nm 발광 [emission] 파장)

- 모세관: 총 길이가 50 cm 및 분리 길이가 40 cm이고 내경이 50 ㎛인     용융 실리카 모세관

- 시료 주입: 10초 유체역학적 (hydrodynamic) 주입

- 분리 전압: 22 kV에서 50분

- 시료: 검액 및 시스템 적합성 용액

분석: 일렉트로페로그램에 나타난 피크들의 면적을 적분한다. 시간 보정된 주요 당사슬 피크들의 상대적 면적 백분율을 계산한다. 검액과 시스템 적합성 용액의 피크들을 비교한다.

나. 방법 B: 형광검출법을 이용한 액체 크로마토그래피

효소 반응 완충액: 100 mM 인산나트륨 용액, pH 7.5

표지 완충액: 메탄올 10 mL에 아세트산나트륨·삼수화물 800 mg과 붕산 400 mg을 녹여 8 % (w/v) 아세트산나트륨·삼수화물 및 4 % (w/v) 붕산 용액을 조제한다.

표지 시약: 표지 완충액에 녹인 100 mg/mL 안트라닐산(anthranilic acid, 2-AA) 용액과 메탄올에 녹인 1 M 나트륨 시아노보로하이드리드(sodium cyanoborohydride)을 준비한다. 동일 부피의 두 용액을 섞어 표지 시약을 조제한다.

[참고: 표지 시약은 차광하여 보관한다.]

용액 A: 50 mM 암모늄 포름산, pH 4.4

용액 B: 아세토니트릴

이동상 조건:

시간 (분)	용액 A (%)	용액 B (%)
0.0	32.5	67.5
48.0	42.5	57.5
49.0	100	0
53.0	100	0
54.0	32.5	67.5
60.0	32.5	67.5

검액 준비: 검체 80 μg을 초소형 원심분리 튜브에 옮기고 PNGase F 3 μL (2.5 units/mL)를 첨가한다.

[참고: PNGase F의 unit 정의는 제조사마다 다르므로 검체에서 N-결합 당을 완전히 분리시키기 위해 필요한 효소양은 실험적으로 확인할 필요가 있다.]

효소 반응 완충액 14 μL를 첨가한 후, 총 부피가 70 μL가 되도록 물을 가한다. 37 ℃에서 18시간 처리한다. 표지 시약 70 μL를 첨가하고, 70 ℃의 흄 후드 (fume hood)에서 2시간 동안 처리한다. 처리액을 냉각시킨 후, 50 % 메탄올 60 μL를 가하고 혼합한 후, 원심분리한다. 상층액 140 μL를 취하여, 새로운 초소형 원심분리 튜브로 옮긴다. 상층액이 든 튜브에 500 μL의 아세토니트릴을 첨가한다. 과량의 표지 시약을 제거하기 위해 친수성 상호작용 고체상 추출 카트리지에 로딩 (loading)한다. 카트리지를 95 % 아세토니트릴 (약 10 mL)로 세척한다. 20 % 아세토니트릴 0.5 mL로 카트리지에서 표지된 당사슬을 용출시킨다. 용출물을 아세토니트릴로 1:1 희석한다.

기기 분석 조건

- 방법: LC

- 검출기: 형광 (360 nm 여기 파장; 420 nm 발광 파장)

- 컬럼: 4.6 mm × 15 cm; 3 μm (직경 10 ㎛ 이하인 다공성 실리카로, 표면에는 알킬아미드기가 공유결합되어 있고 캡핑되어 있지 않음)

- 컬럼 온도: 30 ℃로 유지

- 유속: 0.8 mL/분

- 주입량: 50 uL

분석

크로마토그램 상 피크들의 면적을 적분하고, 주요 당사슬 피크들의 상대적 면적 백분율을 계산한다. 검액과 시스템 적합성 용액의 피크들을 비교한다.

4. 올리고당 분석—시알산

[참고: 단클론 항체의 시알산 함량에 따라 표준 곡선의 범위 또는 검체 질량의 변경이 필요할 수 있다.]

용액 A: 물 2 L에 50 % (w/w) 수산화나트륨 용액 10.4 mL를 희석하여 100 mM 수산화나트륨을 조제한다. [참고: 가능한 용존산소가 적고 높은 저항도(18 MΩ-c m  또는 그 이상)를 갖는 고품질의 물을 사용한다.〕

용액 B: 물 800 mL에 아세트산나트륨 82.0 g과 50 %(w/w) 수산화나트륨 용액 5.2 mL를 넣고 최종부피가 1000 mL가 되도록 물로 희석한다. 이로써 100 mM 수산화나트륨 1 M 아세트산나트륨 용액을 조제한다.

이동상 조건:

시간 (분)	용액 A (%)	용액 B (%)
0.0	93	7
10.0	70	30
11.0	70	30
12.0	93	7
15.0	93	7

아세트산 나트륨 완충액: 20 mM 아세트산 나트륨 용액, pH 5.2

표준 원액:  N-아세틸 뉴라민산 (NeuAc) 및 N-글리코 뉴라민산의 미국약전(USP) 표준품을 아세트산 나트륨 완충액으로 희석하여 0.02 mM 표준 원액을 조제한다.

내부 표준물질 용액: 아세트산 나트륨 완충액을 사용하여 0.1 mM 3-데옥시-D-글리세로-D-갈락토-2-노눌소닉산(3-deoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid, KDN) 용액을 조제한다.

표준액: 아래 표를 참고하여 농도별로 조제한다.

표준	표준물질 농도(mM)	표준 원액의 부피 (mL)	아세트산나트륨 완충액의 부피 (mL)	내부 표준물질 용액의 부피 (mL)
1	10	250	235	15
2	5	125	360	15
3	4	100	385	15
4	2	50	435	15
5	1	25	460	15
6	0.4	10	475	15

시스템 적합성 용액: 아세트산 나트륨 완충액을 사용하여 3 μM NeuAc, NeuGc, KDN를 조제한다. 시스템 적합성 용액은 –70 ℃에서 보관한다.

검액: 0.5 mg에 상응하는 부피의 검체를 초소형 원심분리 튜브로 옮긴다. 전체 부피가 475 μL가 되도록 아세트산나트륨 완충액을 첨가하고, pH 5.2로 조정한다. 테스트 스트립으로 pH를 확인하고, 10 μL의 neuraminidase(10 mU/mL)를 넣는다. 37 ℃에서 5시간 동안 처리하고, 내부 표준 물질 용액 15 μL을 추가한다. 볼텍스 믹서로 혼합한 후, 자동시료주입기 바이알로 옮긴다.

[참고: 검체 및 효소의 품질에 따라 효소 처리 시간은 조절될 수 있다.]

기기 분석 조건

- 방법: LC

- 검출기: 금 전극이 달린 적분 전류측정기(Integrated amperometric detector)

- 컬럼: 4 mm × 25 cm; 10 μm (폴리스티렌/디비닐벤젠으로 만들어진 직경 약 9 ∼ 11 μm인 라텍스 비드로 4차 아민기가 결합되어 있음)

- 유속: 1 mL/분

- 주입량: 50 μL

- 전기 화학 검출기에 다음의 파형을 사용한다.

시간 (초)	전위 (V)	적분
0.00	+0.10	—
0.20	+0.10	시작
0.40	+0.10	종료
0.41	-2.00	—
0.42	-2.00	—
0.43	+0.60	—
0.44	-0.10	—
0.50	-0.10	—

분석:

표준액, 시스템 적합성 용액 및 검액 크로마토그램을 분석한다. 각 크로마토그램 상에 나타난 피크들의 면적을 적분한다. 표준액 및 검액 크로마토그램에서 내부 표준물질에 대한 NeuAc 및 NeuGc의 피크 면적 백분율을 아래와 같이 계산한다.

NeuAc피크면적 백분율(%) 〓 [eqn: {rm N euAc``피크의`면적 it} over {내부``표준``물질``피크의`면적} TIMES 100]

NeuGc피크면적 백분율(%) 〓 [eqn: {rm N euGc``피크의`면적 it} over {내부``표준``물질``피크의`면적} TIMES 100]

표준액 농도와 NeuAc 및 NeuGc의 피크 면적 백분율간 표준 곡선(검량선)을 그린다. 검액 중 NeuAc 및 NeuGc 피크의 면적 백분율을 사용하여 표준 곡선으로부터 검액의 NeuAc 및 NeuGc 농도를 계산한다. 결정된 NeuAc 및 NeuGc 농도를 검액 농도로 나누어 몰비 즉 검체 1분자 당 NeuAc 및 NeuGc의 분자수를 계산한다.

5. 용어

· 2-AA : Anthranilic acid (안트라닐산)

· APTS : 8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (8-아미노파이렌-1,3,6-트리 술폰산)

· CE-SDS : Capillary Electrophoresis-Sodium dodecyl sulfate

(모세관SDS-전기영동법)

· DTT : Dithiothreitol (디티오트레이톨)

· Fab : Fragment antigen-binding (항원결합부위)

· F1 : Fragment 1 (단편 1)

· GlcNAc : N-Acetylglucosamine (N-아세틸글루코사민)

· HC : Heavy chain (중쇄)

· HMWS : High molecular weight species (고분자종, 응집체)

· KDN : 3-deoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid (3-데옥시      -D-글리세로-D-갈락토-2-노눌소닉산)

· LC : Light chain (경쇄)

· LMWS : Low molecular weight species (저분자종, 단편)

· MWCO : Molecular-weight-cut-off (분자량 컷오프)

· NeuAC : Sialic acid, N-AcetylNeuraminic aicd (N-아세틸 뉴라민산)

· NeuGC : N-glycolylneuraminic acid (N-글리콜릴뉴라민산)

· SE-HPLC, SEC : Size-exclusion chromatography (크기배제크로마토그래피)

· TEA : Triethanolamine (트리에탄올아민)

· USP : United states Pharmacopoeia (미국약전)